Kiểm tra độ vô trùng phân xưởng sản xuất thuốc vô trùng

Ở đây bạn sẽ tìm thấy câu trả lời cho những câu hỏi sau: Sản phẩm thuốc nào phải được kiểm tra độ vô khuẩn? Thủ tục phát hành tham số là gì? Kiểm tra độ vô trùng được thực hiện như thế nào? Những điều tra nào phải được thực hiện cùng với thử nghiệm? Quy trình như thế nào nếu có chất đục trong môi trường nuôi cấy? Điều gì cần được xem xét khi xác nhận phương pháp thử nghiệm vô trùng?

Điều này được đề cập rõ ràng trong "Hướng dẫn Sử dụng Thử nghiệm Độ vô trùng" ("Nhà sản xuất không được phép thực hiện các thử nghiệm như vậy ..."). Phương pháp dược điển này là phương pháp trọng tài sẽ được thực hiện trong trường hợp có tranh chấp ("Mục đích của phép thử độ vô khuẩn, giống như của tất cả các phép thử trong dược điển, là cung cấp cho nhà phân tích đối chứng độc lập phương tiện xác minh rằng một nguyên liệu cụ thể đáp ứng các yêu cầu của Dược điển Châu Âu ") và là tiêu chuẩn cho các thay đổi đối với phương pháp (nhà sản xuất không bị loại trừ khỏi"

   

Bản phát hành tham số kiểm tra vô trùng

Mặc dù phần mở đầu của "Chương kiểm tra độ vô trùng" 2.6.1 trong dược điển nói rằng việc kiểm tra độ vô khuẩn phải được thực hiện trên các chất, chế phẩm hoặc sản phẩm được quy định về độ vô khuẩn, nhưng điều này không có nghĩa là việc kiểm tra thực sự phải được thực hiện. - như đã đề cập. 

Do tính không chắc chắn về mặt thống kê của "thử nghiệm độ vô trùng", việc phát hành theo tham số được ưu tiên hơn đối với các sản phẩm được tiệt trùng trong vật chứa cuối cùng. Dược điển đặc biệt đồng ý với điều này (xem hình Bảng 2).

  Tuy nhiên, chương 5.1.1 không có thêm bất kỳ chi tiết nào về việc phát hành tham số ngoài hướng dẫn rằng quy trình phải được xác thực. Để làm được điều này, chúng ta có thể chuyển sang Báo cáo kỹ thuật PDA số 30, trong đó mô tả việc giải phóng thông số cho các sản phẩm được khử trùng bằng hơi nước trong vật chứa cuối cùng (xem bảng 3).

   

Tuy nhiên, không dễ dàng như vậy để chuyển từ thử nghiệm độ vô khuẩn sang giải phóng tham số; các cơ quan có trách nhiệm phải đồng ý. 

Điều này đặc biệt có vấn đề nếu sản phẩm đã được đăng ký ở một số quốc gia và mọi cơ quan có thẩm quyền ghi nhận xét nghiệm độ vô trùng đối với sản phẩm thuốc có liên quan phải được thông báo và đưa ra sự đồng ý của họ. 

Hiện đã có các giấy tờ liên quan đến điều này ở "phía chính thức". Phụ lục 17: Việc phát hành tham số cho Hướng dẫn EU-GMP, có liên quan chặt chẽ với một Chú giải EMEA có liên quan cho Hướng dẫn. Công ước Thanh tra Dược phẩm (PIC) cũng đã ban hành một hướng dẫn liên quan. Các bài báo này đi xa hơn bài báo PDA: cũng như việc phát hành theo tham số của các sản phẩm thuốc vô trùng, nó cũng thường được thảo luận cho các thử nghiệm khác.

Phương pháp kiểm tra độ vô trùng 

Nếu phép thử độ vô trùng được chọn cho các sản phẩm được tiệt trùng trong vật chứa cuối cùng, hoặc nếu không thể giải phóng thông số, ví dụ đối với các sản phẩm được đóng gói vô trùng, thì nên thực hiện phép thử độ vô trùng theo các thông số kỹ thuật trong dược điển. 

Ở đây cũng có thể thực hiện một quy trình khác (trang 1), nhưng nó có thể dẫn đến các cuộc thảo luận bất tận trong trường hợp thanh tra. Phần sau đây trình bày những điểm quan trọng nhất của bài kiểm tra. 

Thử nghiệm vô trùng có trong Ph. Eur. 4,6 là kết quả của sự hài hòa quốc tế đến mức cuối cùng tồn tại một thử nghiệm được công nhận ở Châu Âu cũng như Hoa Kỳ và Nhật Bản. Ngoài phần giải thích đơn giản về bài thi, cần nêu rõ những thay đổi quan trọng nhất so với bài thi trước. 

Vì không phải tất cả các điểm có thể được hài hòa, những điểm sẽ được xử lý trong tương lai ở Hoa Kỳ và Nhật Bản so với ở Châu Âu cũng sẽ được đề cập.

Điều kiện môi trường trong kiểm vô trùng

Thử nghiệm độ vô trùng phải được thực hiện trong điều kiện vô trùng để ngăn ngừa nhiễm bẩn thứ cấp. Để đạt được điều này, môi trường thử nghiệm phải được điều chỉnh phù hợp với quy trình thử nghiệm. 

Tuy nhiên, các biện pháp được thực hiện không được ảnh hưởng đến bất kỳ chất gây ô nhiễm nào hiện có. Ví dụ, trong Hướng dẫn sử dụng phép thử độ vô trùng, không hài hòa, không ràng buộc, dược điển Châu Âu có đề cập đến việc sử dụng băng chuyền tầng phải có trong phòng sạch loại B (theo yêu cầu của EU- GMP-Hướng dẫn sản xuất các sản phẩm vô trùng) hoặc sử dụng chất cách ly. 

Có một số điểm có lợi cho bộ cách ly:

• Mức độ tin cậy của kết quả cao do bảo vệ sản phẩm tối đa (giảm tỷ lệ ô nhiễm thứ cấp)
• Các nhà điều tra của FDA khuyến nghị sử dụng chất cách ly để kiểm tra độ vô trùng.
• Kỹ thuật đã được thử nghiệm và thử nghiệm ở Bắc Mỹ (trong <71> Kiểm tra độ vô trùng, USP đề cập rõ ràng đến việc sử dụng các chất cách ly để kiểm tra độ vô trùng).
• Mức độ linh hoạt cao cho việc triển khai nhân sự vì không yêu cầu quy trình khóa không khí.
• Yêu cầu về không gian thấp (dụng cụ cách ly thử nghiệm vô trùng thông thường có kích thước xấp xỉ 1 x 2 x 2 m)
• Không yêu cầu hệ thống HVAC đắt tiền cho các phòng thử nghiệm vô trùng và bảo trì chúng (các nhà lập pháp không yêu cầu bất kỳ điều kiện môi trường đặc biệt nào đối với chất cách ly. Ở Ph. Eur. Không có yêu cầu cơ bản nào đối với chất cách ly, Kiểm tra độ vô trùng USP - Xác nhận hệ thống cách ly: Chất cách ly để kiểm tra độ vô trùng không cần lắp đặt trong phòng sạch đã được phân loại)
• Không có chi phí cho quần áo vô trùng (mua, chăm sóc, giặt là và khử trùng)
• Giám sát thường xuyên tối thiểu trong thiết bị cách ly, không giám sát môi trường hoặc nhân viên.

Tuy nhiên, cần phải nói rõ rằng chi phí cho một dụng cụ phân lập xét nghiệm vô trùng có xác nhận sẽ có giá khoảng 400.000 euro. Tuy nhiên, chi phí này nhanh chóng chứng minh giá trị của nó, khi chúng tôi cho rằng có thể tránh được kết quả "dương tính giả". Điều này thường có nghĩa là các lô thực sự vô trùng sẽ không bị cách ly do việc thực hiện các xét nghiệm tiếp theo là không thực tế (xem chương 12.H.6 Đọc và đánh giá).

Giám sát môi trường trong vô trùng

Các điều kiện làm việc quy định để thực hiện các thử nghiệm phải được giám sát thường xuyên bằng việc kiểm tra môi trường thích hợp trong khu vực làm việc và sử dụng các biện pháp kiểm tra vô trùng.

Giám sát tình trạng vệ sinh trong các phòng thử nghiệm vô trùng

Trong  bảng 4 và bảng 5, có một gợi ý về việc thực hiện yêu cầu kiểm tra môi trường trong phòng thử nghiệm vô trùng dựa trên các giới hạn và tần suất để giám sát sản xuất. Các phương pháp thông thường đối với quy trình vô trùng được sử dụng để giám sát phòng sạch (chương 12.G Giám sát vi sinh). Không có yêu cầu sâu rộng như trong quy trình vô trùng.

 

   

Giám sát tình trạng vệ sinh trong máy cách ly

Ưu điểm chính của việc sử dụng dụng cụ phân lập xét nghiệm vô trùng là các xét nghiệm được thực hiện trong môi trường tiệt trùng không có người. 

Điều này làm giảm nguy cơ ô nhiễm xuống 0. Tuy nhiên, thật sai lầm khi nghĩ rằng bạn có thể vượt qua mà không cần theo dõi. 

Điều này được nêu rõ trong Phụ lục 1 của Hướng dẫn EU-GMP: ("Việc giám sát phải được thực hiện thường xuyên và nên bao gồm việc kiểm tra rò rỉ của bộ cách ly và hệ thống găng tay / ống bọc"). Câu hỏi đặt ra giới hạn nào sau đó nảy sinh. 

Có vẻ hợp lý khi áp dụng các giới hạn không khí bình thường cho phòng loại A, nhưng nó đã được chấp nhận yêu cầu không khí 0 CFU / m ³ trong dụng cụ cách ly thử nghiệm vô trùng. Điều này cũng phù hợp với các đề xuất trong Hướng dẫn vô trùng của FDA, nơi không có vi sinh vật nào được dung nạp trong không khí đối với các quá trình vô trùng (Các mẫu từ môi trường Loại 100 ... thường không có chất gây ô nhiễm vi sinh). 0 CFU / 25 cm ³ phải đạt được đối với các bề mặt vì đây tất nhiên là độ tiệt trùng thực sự, đã được xác nhận (xem Bảng 6).

  Tuy nhiên, có sự không chắc chắn về phạm vi thử nghiệm để kiểm tra bộ cách ly. Một gợi ý được đưa ra trong Bảng 7.

Bảng 7 Đề xuất giám sát môi trường trong bộ cách ly - tần số Phương pháp giám sát đặc biệt có vấn đề. Người ta phải dự đoán H ₂ O ₂ còn sót lại trong phòng, được thải ra từ bề mặt thạch ẩm và ngăn cản bất kỳ vi sinh vật nào có mặt phát triển. Việc chứng minh sự thúc đẩy tăng trưởng bằng cách sử dụng các sinh vật đối chứng ( đối chứng tích cực ) có ý nghĩa đặc biệt ở đây. Đối với điều này, tối đa 100 CFU tụ cầu ATCC 6538 được nhỏ giọt lên các đĩa hoặc dải không có sự phát triển sau khi ủ. 

Điều này chứng tỏ rằng không có sinh vật nào có thể phát triển được. Đối với thử nghiệm không khí, có thể thử đi đến một giải pháp thỏa đáng bằng cách sử dụng nhiều lần chiết (ví dụ: 2 x 500 l với RCS). 

Đối với thiết bị RCS, hiện nay trên thị trường có bán các dải thạch với chất phụ gia trung hòa phù hợp giúp giảm bớt các vấn đề về việc chứng minh số lượng vi sinh vật trong không khí. Đối với thử nghiệm tiếp xúc bề mặt, Becton-Dickinson đã đưa ra thị trường một đĩa tiếp xúc phù hợp có chứa thạch trung hòa D / E. Các đĩa có phụ gia trung hòa thích hợp cũng nên được sử dụng cho bộ thu với đĩa petri môi trường nuôi cấy rắn.

Phương pháp làm việc vô trùng

Việc kiểm tra phương pháp làm việc vô trùng theo yêu cầu của dược điển ( đối chứng âm tính ) phải được giám sát thường xuyên bằng cách sử dụng các chế phẩm vô trùng đã được chứng minh. 

Các biện pháp kiểm soát này phải được thực hiện cùng lúc với thử nghiệm, vì kết quả phải được sử dụng khi đưa ra quyết định về bất kỳ thử nghiệm tiếp theo nào (xem chương 12.H.6 Đọc và đánh giá). 

Nếu các phương pháp khác nhau được thực hiện (lọc màng / cấy trực tiếp môi trường nuôi cấy) và các sản phẩm thuốc được thử nghiệm yêu cầu các loại chế phẩm khác nhau (ví dụ: ống nước, lọ có chất đông khô, v.v.), thì thử nghiệm phải được thực hiện đối với các phương pháp và chuẩn bị các loại. Nếu nhiều người cùng thực hiện thử nghiệm, thì mỗi người cũng cần phải có các đối chứng âm tính.

Mô tả phương pháp

Dược điển có các mô tả phương pháp cho phương pháp lọc qua màng và phương pháp cấy trực tiếp. Lọc màng được quy định là phương pháp được lựa chọn (Kỹ thuật lọc màng được sử dụng bất cứ khi nào tính chất của sản phẩm cho phép ...) Phương pháp lọc màng được mô tả cho các phương pháp liều lượng sau:

• Dung dịch nước
• Bột hòa tan
• Dầu và dung dịch dầu
• Thuốc mỡ và kem

Phương pháp cấy trực tiếp được mô tả cho các dạng bào chế sau:

• Chất lỏng có dầu
• Thuốc mỡ và kem
• Catgut và các vật liệu khâu phẫu thuật khác dùng trong thú y

Có một vài sửa đổi nhỏ ở đây có thể cực kỳ hữu ích. Ví dụ, đối với các dung dịch nước, số lượng dung dịch không được nêu nhưng đề xuất xác nhận. Các chu kỳ rửa được giới hạn ở 5 x 200 ml, trừ khi một nghiên cứu xác nhận cho thấy rằng điều này không đủ để rửa sạch các chất kháng khuẩn. (Nhật Bản yêu cầu gấp 5 lần 100 ml mỗi bộ lọc cho việc này.) Ngoài ra, có các mô tả chi tiết để thử nghiệm đường tiêm, thuốc nhỏ mắt và các chế phẩm khác không dùng để tiêm. Những điều này đã được thông qua hầu như không thay đổi. 

Chỉ có hai thay đổi. Hướng dẫn "Tổng thể tích được lọc qua màng không được vượt quá 1000 ml, trừ những trường hợp chính đáng và được phép" (đối với lọc qua màng) và "Nếu thể tích làm đầy của vật chứa mẫu lớn hơn 100 ml, thì phương pháp lọc màng phải là được sử dụng, trừ những trường hợp chính đáng và được phép "(đối với phương pháp cấy trực tiếp) khó biện minh một cách khách quan và đã bị loại bỏ và không được thay thế.

Ủ mẫu trong kiểm vô trùng

Văn bản hài hòa quy định thời gian ủ tối thiểu là 14 ngày. Môi trường thioglycolate (chất môi trường) lỏng (để xác định nhiễm vi khuẩn) 30-35 ° C và môi trường phân hủy casein đậu nành (để chứng minh nhiễm nấm) 20-25 ° C. Điều này có nghĩa là tùy chọn trước đó trong USP cho "ủ trong bảy ngày đối với các sản phẩm được khử trùng trong thùng chứa cuối cùng" không còn có thể được sử dụng.

Số lượng mẫu trong kiểm vô trùng

Số lượng mẫu đã được thống nhất như một phần của sự hài hòa, nhưng chỉ USP và JP muốn đưa những con số này vào phần ràng buộc. Ở Ph. Eur, chúng nằm trong "Hướng dẫn sử dụng xét nghiệm độ vô trùng" không ràng buộc như trước đây (Bảng 8). 

Nó chắc chắn là một ý tưởng tốt để tuân theo những đề xuất này. Nếu không thì bảng không thay đổi; chỉ có các quy định về thử nghiệm vật liệu rời đã được thêm vào. Khi xác định số lượng mẫu, số lượng thử nghiệm tối thiểu cũng phải được xem xét (xem Bảng 8), vì số lượng mẫu phải tăng gấp đôi nếu toàn bộ nội dung của vật chứa được thử nghiệm.  

Số lượng mẫu vô trùng

Lượng thử nghiệm yêu cầu được nêu trong bảng trong phần chính của dược điển (và do đó có giá trị ràng buộc). Là một phần của sự hài hòa, một số đại lượng cần thử nghiệm đã được thay đổi (có thể có nghĩa là đánh giá lại các phương pháp đã sử dụng). 

Tổng quan về các yêu cầu được đưa ra trong bảng 9 và bảng 10, cũng hiển thị số lượng được yêu cầu trước đó, để dễ dàng xem liệu có cần xác nhận đối với các sản phẩm thuốc đã được giới thiệu hay không.

     

Đọc và đánh giá mẫu vô trùng

Nhiều lần trong và sau thời gian ủ, các mẫu cấy được kiểm tra vĩ mô để tìm vi sinh vật phát triển có thể nhìn thấy được. Nếu có sự tăng trưởng, thử nghiệm có thể bị gián đoạn và sau đó đánh giá. Nếu không xác định được sự phát triển thì sản phẩm được thử nghiệm phù hợp với thử nghiệm độ vô trùng. Tuy nhiên, nếu có thể phát hiện được sự tăng trưởng thì sản phẩm không thỏa mãn các yêu cầu, trừ khi phép thử có thể được chứng minh là không hợp lệ vì những lý do không liên quan đến bản thân sản phẩm. 

Thử nghiệm chỉ có thể được coi là không hợp lệ và được lặp lại nếu một hoặc nhiều điều kiện tóm tắt trong bảng 11 được đáp ứng. 

Điểm bốn trong bảng11 ("sau khi xác định danh tính của các vi sinh vật được phân lập từ thử nghiệm, sự phát triển của loài này hoặc các loài này có thể được coi là lỗi liên quan đến vật liệu và / hoặc kỹ thuật được sử dụng trong tiến hành kiểm tra độ vô trùng ") chỉ là cơ sở đủ để lặp lại nếu loài sinh vật có thể được chỉ định rõ ràng. 

Một loài tương tự với các phương pháp nhận dạng thông thường là không đủ trong trường hợp này. Điều này được nêu rõ ràng trong "Hướng dẫn sử dụng xét nghiệm độ vô trùng" không hài hòa, không ràng buộc. 

Nếu việc xác định vi sinh vật được sử dụng làm tiêu chí duy nhất để tuyên bố thử nghiệm độ vô trùng không hợp lệ, thì các kỹ thuật nhạy cảm hơn phải được áp dụng như các phương pháp vi sinh / sinh hóa, ví dụ như đánh máy phân tử với các tương đồng RNA / DNA. Có thể hình dung được các lý do khác khiến thử nghiệm độ vô trùng bị vô hiệu, ví dụ, nếu thử nghiệm được thực hiện trong bộ cách ly và có vấn đề với tính toàn vẹn của hệ thống. Hướng dẫn này đã được chứa cho đến bây giờ trong USP.  

Quy trình trong trường hợp môi trường nuôi cấy có độ đục

Nếu vật liệu được kiểm tra làm vẩn đục môi trường nuôi cấy do đó khó xác định được sự tồn tại hoặc sự phát triển của vi sinh vật vào cuối thời gian ủ, thì lượng môi trường nuôi cấy thích hợp phải được chuyển vào các vật chứa mới có cùng môi trường nuôi cấy. 

Hạn chế chính khi thực hiện thử nghiệm, như USP và Ph. Eur. Đã nêu, là cách tiến hành trong trường hợp môi trường nuôi cấy có độ đục. Ph. Eur. Yêu cầu: Việc ủ vật chứa ban đầu và vật chứa với môi trường nuôi cấy đã chuyển phải được tiếp tục trong tổng thời gian ít nhất là 14 + 7 ngày, tính từ lần cấy ban đầu. 

USP yêu cầu các mẫu cấy phụ phải được tạo ra từ ngày thứ ba đến ngày thứ bảy và các mẫu cấy phụ phải được ủ từ 11 đến 7 ngày, để chúng có tổng thời gian ủ là 14 ngày. Mặc dù thời gian ủ này ngắn hơn đáng kể so với Ph. Eur., 

Nhưng quy trình này hơi có vấn đề. Thứ nhất, khi USP xác định thời gian ủ cho thử nghiệm ban đầu, người ta cho rằng các sinh vật cần 14 ngày để nhân lên thành số lượng có thể nhìn thấy trong môi trường lỏng bằng phương pháp cấy trực tiếp. 

Nếu có hiện tượng đục (thường xảy ra với phương pháp cấy trực tiếp), lúc này người ta cho rằng sau ngày thứ ba đã có đủ số lượng sinh vật để phát hiện đủ vật liệu sinh vật khi chuyển vào vật chứa môi trường nuôi cấy mới. 

Đây là một quan niệm sai lầm đáng tiếc. Thời gian ủ dài 14 ngày này không cần thiết vì sinh vật phát triển quá chậm mà vì sinh vật thường có giai đoạn trễ rất dài mà chúng không phát triển. Ví dụ, một sinh vật có vấn đề đối với việc lấp đầy vô trùng là vi khuẩn Propionibacterium acnes (khuẩn ram dương), theo kinh nghiệm của chúng tôi thường không phát triển thành nồng độ sinh vật có thể nhìn thấy được trong môi trường nuôi cấy cho đến sau ngày thứ mười hai. 

Những sinh vật này chắc chắn không được phát hiện với quy trình do USP đề xuất. Sự khác biệt lớn này hiện đã được sửa chữa. Văn bản hài hòa hiện nói rằng 14 ngày sau khi bắt đầu ủ, các phần (mỗi phần không dưới 1 ml - JP yêu cầu chuyển các phần phù hợp và bỏ qua ở đây) của môi trường nuôi cấy phải được chuyển sang các vật chứa mới với cùng môi trường nuôi cấy. Sau đó phải tiếp tục ủ vật chứa ban đầu và vật chứa mới cấy trong ít nhất bốn ngày nữa để có tổng thời gian ủ là 18 ngày.

Môi trường nuôi cấy

Hai dược điển đặt tên như sau là môi trường nuôi cấy:

• Môi trường thioglycolat dạng lỏng Đây chủ yếu được sử dụng để phát hiện vi khuẩn kỵ khí, nhưng cũng có thể được sử dụng để phát hiện vi khuẩn hiếu khí.
• Môi trường phân hủy casein đậu nành Đây là môi trường chủ yếu thích hợp để phát hiện vi khuẩn hiếu khí và nấm.

Các môi trường nuôi cấy khác có thể được sử dụng với điều kiện có bằng chứng về các đặc tính thúc đẩy tăng trưởng của nó và các thử nghiệm xác nhận đã được thực hiện. Không nên sử dụng điều khoản mở đầu này, vì cả Nhật Bản và Hoa Kỳ đều không chấp nhận nó.

Có thông tin rất chi tiết về việc lưu trữ môi trường nuôi cấy:

• Môi trường thioglycolat dạng lỏng Chất này phải được bảo quản trong các vật chứa vô trùng, kín khí ở nhiệt độ từ 2 đến 25 ° C. Nếu hơn một phần ba trên của môi trường chuyển sang màu hồng, nó có thể được sử dụng lại bằng cách đun nóng cho đến khi màu hồng biến mất sau đó nhanh chóng làm lạnh. Phương tiện chỉ có thể được lưu trữ trong dài hạn với sự xác nhận có liên quan (JP và USP sẽ không áp dụng điều khoản này). Câu hỏi "dài hạn" nghĩa là gì vẫn chưa được trả lời - nhưng chắc chắn là dài hơn 1 tháng. Nếu môi trường được bảo quản trong các vật chứa không đậy kín, nó có thể được sử dụng trong một tháng với điều kiện tiên quyết là các đặc tính thúc đẩy tăng trưởng đã được thử nghiệm trong vòng hai tuần kể từ khi môi trường được sử dụng và chất chỉ thị màu không bao phủ quá 1/3 phía trên.
• Môi trường phân hủy casein đậu nành Chất này phải được bảo quản trong các vật chứa vô trùng, đậy kín ở nhiệt độ từ 2 đến 25 ° C, trừ khi môi trường này phải được sử dụng ngay lập tức. Phương tiện chỉ có thể được lưu trữ lâu dài sau khi xác nhận có liên quan.

Kiểm soát môi trường nuôi cấy

Mỗi lô môi trường nuôi cấy được sử dụng phải tuân theo các phép thử được liệt kê dưới đây, có thể được thực hiện trước hoặc cùng lúc với phép thử sản phẩm đang được khảo sát:

• Độ vô trùng : Các mẫu môi trường nuôi cấy được ủ trong 14 ngày tùy theo mục đích sử dụng, tức là môi trường thioglycate thường được ủ ở 30-35 ° C và môi trường phân hủy casein đậu nành ở 20-25 ° C. Không có sự phát triển của vi sinh vật phải được phát hiện.

Dược điển Châu Âu quy định rằng mỗi lô sản xuất phải được thử nghiệm trên môi trường sẵn sàng sử dụng. Yêu cầu này không quá cao đối với JP và USP. Hai dược điển này muốn chỉ ra rằng, trong những trường hợp thích hợp, việc kiểm tra định kỳ các lô sản xuất khác nhau được sản xuất từ ​​cùng một lô môi trường khử nước là có thể chấp nhận được. Bởi vì luôn có nguy cơ môi trường bị tiệt trùng quá mức và do đó các đặc tính thúc đẩy tăng trưởng bị giảm, ví dụ như do đường caramen hóa, tùy chọn này không được sử dụng trong bất kỳ trường hợp nào cho các thử nghiệm đối với Nhật Bản hoặc Hoa Kỳ. Điều này ít nhất sẽ là vấn đề đối với Hoa Kỳ, bởi vì vấn đề khử trùng quá mức được đề cập rõ ràng trong Hướng dẫn của FDA về Thanh tra các Phòng thí nghiệm Kiểm tra Chất lượng Dược phẩm Vi sinh. Để kiểm tra các đặc tính thúc đẩy tăng trưởng, các mẫu môi trường nuôi cấy được cấy một lượng nhỏ (10 đến 100 CFU) vi sinh vật và ủ. Các vi sinh vật phải tạo độ đục có thể nhìn thấy được trong thời gian quy định. Các vi sinh vật sau đây được chỉ định:

• Môi trường thioglycolat dạng lỏng: Clostridium sporogenes, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus Điều tra viên của FDA cũng mong đợi các chủng hoang dã được sử dụng (các sinh vật đã được tìm thấy như một phần của quá trình giám sát tại các đơn vị).
• Môi trường tiêu hóa casein đậu nành: Aspergillus niger, Bacillus subtilis, Candida albicans Thời gian ủ lên đến ba ngày đối với vi khuẩn và năm ngày đối với nấm. Các chủng tham chiếu được đưa ra trong Bảng 12. Số lượng đoạn văn từ văn hóa gốc được giới hạn ở 5, như trước đây.




Bảng 12 Sinh vật tham chiếu cho phép thử độ vô trùng để xác nhận phương pháp và kiểm soát môi trường nuôi cấy

Sinh vật tham chiếu cho phép thử độ vô trùng để xác nhận phương pháp và kiểm soát môi trường nuôi cấy
Sinh vật	Chủng	Mới được ghi lại
Vi khuẩn hiếu khí
Staphylococcus aureus	ATCC 6538, CIP 4,83, NCTC 10788, NCIMB 9518	-
Bacillus subtilis	ATCC 6633, CIP 52,62, NCIMB 8054	-
Pseudomonas aeruginosa	ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118	-
Vi khuẩn k an khí
Clostridium sporogenes	ATCC 19404, CIP 79.3, NCTC 532	ATCC 11437
Nấm
Candida albicans	ATCC 10231, IP 48,72	NCPF 3179, ATCC 2091, IP1180.79
Aspergillus niger	ATCC 16404	IP 1431.83, IMI 149007

Bảng 13 Vi sinh vật để xác nhận phương pháp

Vừa phải	Vi sinh vật
Môi trường thioglycolat dạng lỏng	Clostridium sporogenes Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus
Môi trường tiêu hóa casein đậu nành	Trực khuẩn Aspergillus niger Candida albicans.

Sau khi ủ, phải phát hiện được sự phát triển so với các vật chứa đối chứng đi kèm. Sau đó, phương pháp này có thể được xem là hợp lệ. Nếu quan sát thấy sự ức chế của vi sinh vật, điều này phải được loại bỏ, ví dụ như bằng cách trung hòa, pha loãng, tăng thể tích rửa, v.v ... Đặc biệt đối với các chế phẩm có hàm lượng chất kháng khuẩn cao, có thể hữu ích để kiểm tra lại sự thúc đẩy tăng trưởng sau khi ủ. . Câu hỏi về thời điểm xác nhận phải được thực hiện được quy định rõ ràng:

• Nếu việc kiểm tra độ vô trùng được thực hiện với một sản phẩm mới
• Nếu có sự thay đổi trong các điều kiện thực nghiệm của thử nghiệm, điều này không thể hiện rõ khi nào người ta phải giả định những thay đổi trong việc thực hiện thử nghiệm (theo tôi điều này không nên hiểu theo nghĩa quá hẹp).

Một câu hỏi quan trọng khác là tần suất và lô sản phẩm mà loại xác nhận này phải được thực hiện. Không có thông tin trực tiếp về điều này trong các quy định về kiểm tra độ vô trùng trong dược điển. 

Tuy nhiên, trong chương Xác thực việc thu hồi vi sinh vật từ các điều khoản dược lý của USP, nó quy định rằng ba lần xác nhận độc lập nên được thực hiện. FDA giải thích rằng việc xác nhận phải được thực hiện với ba lô khác nhau để loại trừ bất kỳ ảnh hưởng nào của công thức sản phẩm thuốc, v.v. ("Ba thử nghiệm cũng nên được thực hiện trên ba lô khác nhau để chứng minh rằng thử nghiệm không bị ảnh hưởng bởi trong các biến thể đặc điểm kỹ thuật của các lô khác nhau của công thức "). 

Mặc dù điều này chỉ liên quan đến việc xác nhận các phép xác định số lượng vi sinh vật, Luôn có các cuộc thảo luận về việc liệu các xác nhận có thể chuyển sang nồng độ hoạt chất khác hay không. Dược điển Châu Âu quy định rằng việc xác nhận phải được thực hiện nếu việc kiểm tra độ vô trùng được thực hiện đối với một sản phẩm mới hoặc nếu có sự thay đổi trong các điều kiện thử nghiệm. 

Điều này có nghĩa là việc xác nhận phải được thực hiện đối với mọi sản phẩm thuốc mới và trong trường hợp có những thay đổi trong quá trình thực hiện thử nghiệm của thử nghiệm. Ngoại lệ duy nhất có thể hình dung được là nếu một sản phẩm thuốc có thành phần giống hệt nhau có nhiều liều lượng hoạt chất khác nhau. 

Trong trường hợp này, việc xác nhận nồng độ cao nhất và thấp nhất có thể chuyển sang các liều lượng ở giữa với điều kiện là hai phương pháp đã được xác nhận là giống hệt nhau.